KOD-Plus-Neo是基于一種ji端嗜熱的海洋古生菌Thermococcus kodakarensis的DNA聚合酶。這種聚合酶由于其高效的3’-5’核酸外切酶活性（校對活性）。該產(chǎn)品含有一種du特的“延伸增強劑"，可抑制傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的“平臺效應"。因此，與先前版本的KOD-Plus（KOD-201）相比，該試劑表現(xiàn)出更高的擴增效率和延伸能力。此外，這種酶對于PCR延伸步驟僅需要30秒/kb。這有利于長片段PCR。這種酶含有兩種抑制聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性的抗KOD DNA聚合酶抗體和，從而支持熱啟動PCR。
產(chǎn)品特點
? 比普通Taq DNA聚合酶高80倍的PCR保真度。
? 與傳統(tǒng)PCR相比，“延伸增強劑"能夠實現(xiàn)更高的擴增效率和延伸能力。
? PCR延伸步驟只需要30秒/kb。
? 兩步循環(huán)條件可用于使用≥20 mer引物的擴增（退火溫度，Tm>63°C）。
產(chǎn)品組分
KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)* | 200 μL×1 |
10 x PCR Buffer for KOD -Plus-Neo | 1 mL×1 |
25 mM MgSO4 | 1 mL×1 |
2 mM dNTPs | 1 mL×1 |
引物設計
? 引物應為22-35個堿基，Tm>63℃
? 引物的最佳GC含量為45-60%。5’端和3’端的理想GC含量分別為60-70%和40-50%。
? 長片段擴增的引物應為25-35個堿基，Tm>65°C。
? 不能使用含有肌苷的引物
? 建議使用最近鄰法計算引物的Tm。本手冊中的Tm值是使用以下參數(shù)使用該方法計算的。Na+濃度：50 mM 寡核苷酸濃度：0.5 µM
PCR產(chǎn)物的克隆
? KOD-Plus-Neo由于其3’-5’核酸外切酶活性。因此，PCR產(chǎn)物為平端產(chǎn)物，可以根據(jù)平端克隆方法進行克隆。
? KOD-Plus-Neo的PCR產(chǎn)物應在限制性內(nèi)切酶處理之前進行純化。KOD DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在PCR反應結束時仍然存在。
? 克隆KOD DNA聚合酶產(chǎn)生的平端PCR產(chǎn)物推薦專用TA克隆試劑盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)"
實驗步驟
1. 標準反應體系配置
反應物準備前，除酶溶液外，所有成分均應wan全解凍。
組分 | 體積 | 終濃度 |
10x Buffer for KOD -Plus- Neo | 5 μL | 1x |
2 mM dNTPs | 5 μL | 0.2 mM each |
25 mM MgSO4 | 3 μL | 1.5 mM |
10 pmol/μL Primer #1 | 0.75–1.5 μL | 0.15–0.3 µM |
10 pmol/μL Primer #2 | 0.75–1.5 μL | 0.15–0.3 µM |
Template DNA | X μL | Genomic DNA ≤ 200 ng/50 μL Plasmid DNA ≤ 50 ng/50 μL cDNA ≤ 200 ng（RNA equiv.)/50 μL |
PCR grade water | Y μL | |
KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL) | 1 μL | 1.0 U/50 μL |
總體積 | 50 μL |
**不要使用其它試劑盒或其它公司的dNTP
注意：
最佳引物濃度為0.3 µM。在長片段（≥10kb）的情況下，降低引物濃度（0.15µM）可能會產(chǎn)生更有效的擴增。
二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加有利于擴增富含GC的靶標。在DMSO存在的情況下，PCR保真度不會降低（參見步驟2，循環(huán)條件）。
cDNA或基因組DNA中的污染RNA會通過螯合Mg2+來抑制PCR反應。應使用<200 ng RNA的模板DNA進行PCR。
模板DNA的質量應通過電泳檢查。模板DNA的長度和純度會影響擴增結果。
含有尿嘧啶的模板不能用于擴增。
對于PCR反應，建議使用薄壁管。建議總反應體積為50 μL。
2. 循環(huán)條件
推薦≥20 mer的引物，Tm>63°C的兩步循環(huán)條件用于有效擴增。
兩步循環(huán)：
如果引物的Tm值超過63°C，建議采用兩步循環(huán)。
注意：
對于使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg2+濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chǎn)率。
二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利于擴增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應根據(jù)引物的Tm來確定。
<25 mer or Tm <68℃: 加2%
≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%
如果擴增失敗，可能需要3步循環(huán)
三步循環(huán)：
當引物的Tm小于63℃時，應使用三步循環(huán)。
注意：
對于使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg2+濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chǎn)率。
二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利于擴增富含GC的片段。
降落PCR：
如果在2步和3步循環(huán)條件下觀察到非特異性擴增（在PCR產(chǎn)物電泳后觀察到額外的條帶），降落PCR則可以提高特異性。
注意：
對于使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg2+濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chǎn)率。
二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利于擴增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應根據(jù)引物的Tm來確定。
<25 mer or Tm <68℃: 加2%
≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%
應用實例
性能數(shù)據(jù)：
1. PCR保真度
用TArget克隆技術對從人基因組DNA中擴增的人β-珠蛋白基因產(chǎn)物進行序列分析，測定突變頻率。KOD-Plus-Neo表現(xiàn)出ji好的保真度，突變頻率與以前版本的酶（KOD-Plus-）相同。
2. 延伸能力
根據(jù)每種酶的推薦條件，通過幾種PCR酶從人類基因組DNA中擴增出各種大小的片段。KOD-Plus-Neo成功擴增了17.5 kb的片段。
3. 低拷貝模板擴增
使用0.5 ng cDNA模板擴增四個基因。模板由HeLa細胞的總RNA合成。KOD-Plus-Neo成功擴增了所有基因。
4. 延伸速度
不同的擴增時間從人類基因組DNA（50ng）中擴增β-珠蛋白基因（3.6 kb）。KOD-Plus-Neo可以用30秒/kb的延長時間擴增3.6 kb的靶標。
應用數(shù)據(jù)：
1. 各種蛋白激酶片段的擴增
利用HeLa細胞總RNA合成的cDNA擴增各種蛋白激酶開放閱讀框。KOD-Plus-Neo成功擴增了所有片段。
2. 長片段擴增
使用不同濃度的引物從人類基因組DNA中擴增長片段。過多的引物會抑制擴增。因此，應使用約0.15 µM的較低引物濃度擴增長片段（>10 kb）。
常見問題及解決辦法
問題 | 可能的原因 | 解決辦法 |
無產(chǎn)物或低產(chǎn)量 | 循環(huán)條件不合適 | 使用三步循環(huán)，將退火溫度逐漸降低至最大Tm-5–10°C |
將延伸時間延長至1分鐘/kb | ||
將循環(huán)次數(shù)增加2-5個循環(huán) | ||
Mg2+濃度低 | 將Mg2+濃度增加至2 mM | |
目標序列GC含量高 | 加入2–5%的DMSO | |
引物的質量和/或濃度問題 | 將引物濃度逐步降低至0.15 µM | |
使用新的引物 | ||
重新設計引物 | ||
模板DNA的質量和/或濃度問題 | 檢查模板DNA的質量 | |
增加模板DNA的濃度 | ||
酶濃度低 | 將酶濃度提高至1.5–2.0 U/50 μL | |
彌散條帶或雜帶 | 循環(huán)條件不合適 | 將循環(huán)次數(shù)減少2-5個循環(huán) |
從3步循環(huán)更改為2步循環(huán) | ||
從2步循環(huán)更改為降落PCR | ||
引物的質量問題 | 使用新的引物 | |
重新設計引物 | ||
模板DNA太多 | 減少模板DNA的濃度 | |
Mg2+濃度太高 | 將MgSO4逐步降低至1.0 mM | |
酶濃度太高 | 將酶濃度降至0.5–0.8 U/50 μL | |
TA克隆效率差 | PCR產(chǎn)物具有平末端 | 使用專用TA克隆試劑盒TArget clone™-Plus-(Code No. TAK-201) |
參考文獻
1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).
2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).
3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).
4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).
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